Tief beeinflusst vom ersten Spiel der Serie, Desperados: Wanted Dead or Alive, ermöglicht Desperados III Ihnen, jede Mission mit einer Vielzahl von Lösungen und Wegen anzugehen. Da die Gang des Spielers immer in der Unterzahl ist, gewährleistet nur die intelligente Nutzung der Umgebung und der einzigartige Charakter jedes Desperados den Sieg.

Sie übernehmen die Kontrolle über eine rebellische Bande, die sich in ein hochfunktionales Team von Helden und Heldinnen verwandelt. Die sehr unterschiedlichen und mächtigen Persönlichkeiten kämpfen anfangs um Zusammenarbeit, vereinen jedoch schließlich ihre Kräfte, um ihre einzigartigen Fähigkeiten zu kombinieren und sich einem scheinbar überlegenen Gegner zu stellen. Verfolgt von skrupellosen Banden und korrupten Gesetzeshütern müssen die Desperados in jeder Mission die Chancen umkehren.