Ezio kehrt zurück und kämpft gegen den mächtigen Templerorden. Nun, als legendärer Meister-Assassine, muss er nach Rom reisen, dem Zentrum von Macht, Gier und Korruption, um das Herz des Feindes zu treffen. Ezio wird eine ganze Bruderschaft anführen, die sich ihm anschließen wird, und nur durch Zusammenarbeit werden die Assassinen in der Lage sein, ihre tödlichen Feinde zu besiegen.

Assassin's Creed Brotherhood bietet auch ein völlig innovatives Multiplayer-Element, bei dem die Spieler den Templern helfen können, indem sie Abstergo nutzen, um in der Kunst des Attentats zu trainieren, um die Assassinen ein für alle Mal zu eliminieren. Die Spieler haben die Möglichkeit, aus einer Reihe einzigartiger Charaktere zu wählen - jeder von ihnen besitzt eigene Waffen und spezielle Attentatstechniken - und ihre Fähigkeiten gegen andere Spieler aus der ganzen Welt in verschiedenen Spielmodi zu kombinieren.