Ецио се завръща и се бори срещу могъщия Орден на тамплиерите. Сега, като легендарен Майстор Асасин, той трябва да пътува до Рим, център на властта, алчността и корупцията, за да удари в сърцето на врага. Ецио ще води цялото Братство, което ще се обедини около него, и само чрез съвместна работа Асасините ще могат да победят своите смъртоносни врагове.

Assassin's Creed Brotherhood също така предлага напълно иновативен мултиплейър елемент, в който играчите ще могат да помагат на тамплиерите, използвайки Абстерго за обучение в изкуството на убийството, за да елиминират Асасините веднъж завинаги. Играчите ще имат възможността да изберат от редица уникални персонажи - всеки от които притежава свои собствени оръжия и отличителни техники за убийство - и да комбинират своите умения срещу други играчи от цял свят в различни игрови режими.